結(jié)合毛細(xì)管液相色譜分離技術(shù)，Agilent 8800 電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀 在 MS/MS 質(zhì)量轉(zhuǎn)移模式下可痕量測(cè)定磷酸肽中的磷與含硫多肽中的硫。使 用 LC-ICP-MS 可獲得含硫和含磷物質(zhì)的絕對(duì)檢測(cè)限（分別為 11 fmol 和 6.6 fmol）。硫的同位素比值測(cè)定結(jié)果與其理論值高度吻合，從而證 明干擾得以有效消除。所觀測(cè)到的硫和磷的峰形和信噪比表現(xiàn)優(yōu)異。測(cè)定結(jié)果 表明 capLC 與 ICP-MS/MS 聯(lián)用技術(shù)在使用非特殊標(biāo)樣測(cè)定含硫和含磷多肽的 高靈敏度和同時(shí)絕對(duì)定量分析方面有巨大潛力。

LC-MS/MS 用于定量分析制藥/生物制藥和臨床研究中的 目標(biāo)蛋白質(zhì)。此方法常常使用同位素標(biāo)記的合成蛋白質(zhì)和 多肽作為內(nèi)標(biāo)來定量分析相應(yīng)的目標(biāo)化合物。與之相反， LC-ICP-MS 通過測(cè)定目標(biāo)化合物中含有的雜原子硫和磷對(duì) 蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行非特異性定量分析。通過這種方式可以 使用含有雜原子的不同化合物，并將單個(gè)含雜原子的非蛋 白質(zhì)化合物作為通用標(biāo)樣對(duì)其進(jìn)行定量。不幸的是，硫和 磷的檢測(cè)限因其高電離能和單四極桿 ICP-MS (ICP-QMS) 的多原子干擾而大打折扣——即使使用了碰撞/反應(yīng)池 (CRC)。雖然扇形磁場(chǎng)高分辨 ICP-MS (HR-ICP-MS) 也被用 于該類應(yīng)用，但迄今為止仍沒有任何 ICP-MS 儀器能夠達(dá) 到已報(bào)道的 ESI-MS/MS 儀器使用同位素標(biāo)記合成多肽時(shí) 所具有的檢測(cè)限（特別是對(duì)于硫）。表 1 列出了關(guān)于 LCICP-MS 對(duì)于硫和磷檢測(cè)限的已發(fā)表數(shù)據(jù)，包括所用的 ICPMS 技術(shù)和分離技術(shù)。在這項(xiàng)工作中，我們采用了 Agilent 8800 電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀（也簡(jiǎn)稱為 ICP-MS/ MS）通過對(duì)硫和磷雜原子進(jìn)行絕對(duì)定量分析來測(cè)定蛋白質(zhì) 和多肽。

較之傳統(tǒng)的儀器或 ICP-MS，Agilent 8800 在八極桿反應(yīng) 池 (ORS3 ) 和四極桿質(zhì)量過濾器 (Q2) 前方配備了額外的主 四極桿質(zhì)量過濾器 (Q1)。在該串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)中，Q1 作為 單位質(zhì)量過濾器僅允許目標(biāo)分析物質(zhì)量數(shù)的離子進(jìn)入反應(yīng) 池，排除了所有其他離子。因?yàn)榈入x子體和基質(zhì)中的離子 被 Q1 排除，確保了即使在復(fù)雜高基質(zhì)樣品中，ORS3 中的 反應(yīng)過程也能得到精確控制從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測(cè)量，并且靈敏 度也得到了極大的增強(qiáng)。色譜分離過程通過與 8800 ICPMS/MS 聯(lián)用的安捷倫 cap-LC 系統(tǒng)完成。

實(shí)驗(yàn) 試劑和材料 超純水（Millipore，東京，日本），HPLC 和分析試劑級(jí)乙 腈以及甲酸（Wako Pure Chemical，Ltd.，大阪，日本）。 ICP-MS 標(biāo)準(zhǔn)品（SPEX CertiPrep，Inc.，Metuchen， NJ，美國）、對(duì)硝基ben酚磷酸二酯（BNPP，純度 99%） 和蛋氨酸（純度 ≥ 99% 82）（Sigma Aldrich，Steinheim， 德國)。磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)品的氨基酸序列為 LRRApSLG 和 KRSpYEEHIP，含硫多肽標(biāo)樣為 ACTPERMAE 和 VPMLK。 所有多肽購自 AnaSpec（Fremont，CA，美國），純度 都 ≥ 95%。

制備含硫和磷的標(biāo)樣 使用 BNPP 和蛋氨酸在 1% 流動(dòng)液相 B 基質(zhì)中（這是液 相色譜梯度淋洗的起始條件）制備 0、25、50、100 和 200 ng/mL（以硫、磷元素濃度計(jì)）的含硫和磷的校準(zhǔn)標(biāo)樣。 磷酸肽溶液的制備 分別配制三份溶液（100 ng/mL，以磷元素濃度計(jì)） 以確定每個(gè)多肽的保留時(shí)間和純度。溶液 1 包含 LRRApSLG 和 ACTPERMAE，而溶液 2 包含 KRSpYEEHIP 和 VPMLK。 兩種溶液中均包含大約 100 ng/mL BNPP 和蛋氨酸。將溶 液 1 和 2 按重量法 1:1 混合配制成 3

儀器

capLC 系統(tǒng) Agilent1200 系列，采用 Agilent Zorbax SB C18, 5 µm, 150 x 0.3 mm 反相毛細(xì)管色譜柱的。流動(dòng)相 A 和 B 分別包 含水和乙腈。兩種流動(dòng)相都含有 0.1% 甲酸和 10 ng/mL 鍺 （作為 ICP-MS 內(nèi)標(biāo)使用）。進(jìn)樣量為 1-2 µL。液相色譜流 速為 5 µL/min，液相色譜梯度淋洗條件如下：0-3 分 鐘：1% B，等度；3-35 分鐘：1-60% B，線性梯度。 Cap LC-ICP-MS 接口 使用安捷倫 capLC 接口（安捷倫 G3680A 毛細(xì)柱液相色 譜接口套件，圖 1）將 capLC 色譜柱連接到 ICP-MS，此 capLC 接口結(jié)構(gòu)為一個(gè)小的石英霧化室內(nèi)包含一個(gè)消耗型 的霧化器。

ICP-MS 使用 Agilent 8800 電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀。以 80 mL/min 的流速從霧化氣通道通入氧氣（氬:氧比例為 8:2） 到霧化器氣體中。池氣體：氧氣，流速為 0.35 mL/min。 樣品流速：5 µL/min。31 P、32 S 和 34 S 的積分時(shí)間 150 ms （每個(gè)峰值一個(gè)點(diǎn)）。使用配于 30% 的乙腈中 100 ng/mL 磷 和硫的標(biāo)樣對(duì) 8800 進(jìn)行優(yōu)化，以滿足低的磷、硫檢出限 要求，流速為 5 µL/min，注射泵進(jìn)樣。使用Agilent ICP-MS MassHunter 軟件進(jìn)行液相色譜操作和對(duì)色譜峰進(jìn)行積分。

在 MS/MS 模式下使用 Agilent 8800 消除對(duì)硫和磷的干擾 8800 在 MS/MS 質(zhì)量轉(zhuǎn)移模式下操作以消除對(duì)硫和磷的干 擾。在圖 2 中，上方的示意圖 (a) 將 Q1 設(shè)為 m/z = 32， 從而允許 32 S + 進(jìn)入反應(yīng)池，排除了其它質(zhì)量數(shù)的干擾 （包括質(zhì)荷比為 48 的離子）。S+ 在池內(nèi)通過與氧氣反應(yīng)轉(zhuǎn) 換為 SO+。Q2 設(shè)置為 m/z = 48，從而允許 SO+ 進(jìn)入檢測(cè) 器，排除了 m/z = 32 的所有原始質(zhì)量數(shù)干擾物。m/z = 48 的干擾物在碰撞反應(yīng)池之前已由 Q1 排除。這是 MS/MS 結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)大消干擾能力的關(guān)鍵所在——實(shí)現(xiàn)了在可控條 件下進(jìn)行準(zhǔn)確無干擾的反應(yīng)物離子測(cè)量。

2 下方的示意圖 (b) 顯示了對(duì)磷的測(cè)定設(shè)置：Q1 設(shè)置 為 m/z = 31，從而允許 31 P+ 通過，排除了其它質(zhì)量數(shù)的 干擾（包括 m/z = 47）。31 P+在池內(nèi)通過與氧氣反應(yīng)轉(zhuǎn)換 為 PO+。Q2 設(shè)置為 m/z = 47，從而允許反應(yīng)產(chǎn)物 PO+ 進(jìn) 入檢測(cè)器。m/z 47 = 處的干擾物在碰撞反應(yīng)池之前已 由 Q1 排除。Q1 消除的干擾物包括：（m/z = 47 處 47 Ti +、 32 S14 NH+、32 S15 N+、15 N16 O+、12 C35 Cl + 對(duì) 31 P16 O+ 的干擾， 以及 m/z = 48 處 48 Ti +、36 Ar 12 C+、P16 OH+、31 P17 O+、 48 Ca+對(duì) SO+的干擾），Q2 消除的干擾物包括：（15 N16 O+、 14 N16 OH+、14 N17 O+、12 C18 OH+對(duì) 31 P+的干擾，以及 16 O+、 15 N17 O+、15 N16 OH+、14 N18 O+ 對(duì) 32 S+ 的干擾），如各圖中 所示。

……

結(jié)論 對(duì)蛋白質(zhì)中天然存在的 ICP-MS 可檢測(cè)元素進(jìn)行高靈敏度和 無干擾的定量檢測(cè)將擴(kuò)展 LC-ICP-MS 方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中 的應(yīng)用。通過與 cap-LC 分離方法聯(lián)用，Agilent 8800 電 感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀利用 LC-ICP-MS 分析含硫和磷 物質(zhì)時(shí)可獲得低檢測(cè)限（分別為 11 fmol 和 6.6 fmol）。 在 MS/MS 質(zhì)量轉(zhuǎn)移模式下操作時(shí)，Agilent 8800 通過使 分析物與氧氣反應(yīng)并測(cè)量產(chǎn)生的氧化物離子，從而有效消 除了對(duì)磷和硫的干擾。硫的同位素比測(cè)量值與理論值吻合 良好，證明硫干擾物得以有效消除，并且由于串聯(lián)質(zhì)譜模 式能保留正確的同位素模式，可以通過同位素稀釋法來校 正因梯度淋洗導(dǎo)致的硫靈敏度的變化。 所測(cè)得的含硫和磷物質(zhì)及多肽的峰形和信噪比佳。這也是將通用標(biāo)樣應(yīng)用于多肽和磷酸肽的同步絕對(duì)定量分析。 這種全新的功能強(qiáng)大的硫磷（特別是硫）檢測(cè)法將使 LCICP-MS 在諸多領(lǐng)域中得到應(yīng)用：如藥物研究（藥物和代 謝物）、環(huán)境分析（農(nóng)藥）和納米技術(shù)（工程納米顆粒的 表征）