摘要抗體藥物偶聯(lián)物 (ADCs) 是一類快速增長的生物治療藥物。在生產(chǎn)過程中，需要監(jiān)測ADCs 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs)，例如藥物/抗體比率 (DAR) 和聚集體。本應(yīng)用簡報展示了 Agilent Cary 3500 紫外-可見多池分光光度計在分析 ADCs 的 DAR 和聚集指數(shù)方面的功能優(yōu)勢，以及在多種溫度下同步測量多個樣品的功能。Cary 3500 紫外可見分光光度計憑借軟件中的自定義方程功能、簡單的方法和準(zhǔn)確的溫度控制，能夠輕松、可靠地測定 DAR 和聚集指數(shù)。

前言ADCs 憑借特異性和靶向作用模式，成為制藥公司藥物研發(fā)管線中快速增長的一類生物治療藥物[1]。通過測定 DAR 可確定與每個抗體偶聯(lián)的細(xì)胞毒性小分子的平均數(shù)量，該值對產(chǎn)品的安全性和有效性有很大的影響，因此通常被視為一種 CQA。研究表明，DAR 還會顯著影響產(chǎn)物形成聚集體的趨勢[2]，從而引起免疫反應(yīng)。因此，在開發(fā)過程中分析 ADCs 的 DAR 和聚集體至關(guān)重要。紫外-可見光譜是生物制藥實(shí)驗(yàn)室中的一種常用技術(shù)，常用于可靠、便捷地測定蛋白質(zhì)濃度。在本應(yīng)用簡報中，我們證明了只要細(xì)胞毒性小分子含有紫外-可見發(fā)色團(tuán)，并且其最大吸收波長與抗體支架不同，那么紫外-可見光譜法也可用于測定ADC 的 DAR[1]。Cary 3500 紫外-可見分光光度計使用簡單快捷，具有高通量，并且可同時在四種不同的溫度下為四對比色皿提供準(zhǔn)確的溫度控制。同步測量多個樣品的紫外吸光度可消除不利變量，提高所生成結(jié)果的可靠性。簡單的方法設(shè)置和定制計算功能便于用戶使用。Cary 3500 紫外-可見分光光度計與 Agilent OpenLab軟件套裝兼容。在配置 OpenLab 軟件后，它可以支持實(shí)驗(yàn)室遵循 FDA 21 CFR Part 11 法規(guī)認(rèn)證指南。在本研究中，我們展示了 Cary 3500 紫外-可見分光光度計在測定 DAR 和聚集指數(shù)方面的優(yōu)勢。

實(shí)驗(yàn)部分儀器Agilent Cary 3500 紫外-可見多池分光光度計，配有八個比色皿位置。使用 Cary UV Workstation 軟件（1.0.1284 版）和Cary 3500 多區(qū)控溫附件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，所用參數(shù)如表 1 所示。

赫賽汀及其 ADC 類似物購自新加坡當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷商。兩種單克隆抗體 (mAb) 樣品均使用 Vivaspin 500 超濾濃縮離心管離心柱 (10 kDa MWCO; Sartorius) 進(jìn)行濃縮。安捷倫矩形 UV 比色皿，10 mm，700 µL，開口（貨號 5061-3391）與 Cary 3500 紫外-可見分光光度計配套使用。新制超純水產(chǎn)自配置 0.22 µm 膜式終端過濾器 (Merck Millipore)的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)。

方法實(shí)驗(yàn)中所用赫賽汀及其 ADC 類似物的濃度為 0.5 mg/mL。為了演示 DAR 值的變化，以不同的比例混合赫賽汀及其 ADC 類似物（見圖 2 中的表格），并使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計進(jìn)行測量。使用 Cary UV Workstation 軟件中的公式 1 計算 DAR。為了研究溫度對 DAR 的影響，使用多區(qū)控溫附件平行進(jìn)行了四個實(shí)驗(yàn)（圖 1）。使用 280 nm 處的紫外吸光度，估算得到本實(shí)驗(yàn)中所用的“經(jīng)離心柱濃縮”ADC 的濃度為 25 mg/mL。對于 25 mg/mL 樣品，用 390 µL 水將 10 µL 樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉(zhuǎn)移到四個比色皿中，用 Cary 3500紫外-可見分光光度計在 60、70、80 和 90 °C 下同步孵育90 分鐘。在進(jìn)行基線校正后測量樣品的吸光度，并用公式 1計算 DAR 值。為了研究聚集效應(yīng)隨時間的變化，用 390 µL 水將 10 µL25 mg/mL 的樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉(zhuǎn)移到比色皿中，在 Cary 3500 紫外-可見分光光度計中孵育 90 分鐘，并以不同的時間間隔測量樣品的吸光度。使用公式 2 計算聚集指數(shù)。

結(jié)果與討論使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計測定藥物/抗體比率為了模擬 ADC 的偶聯(lián)過程，將 ADC 和游離抗體以不同的比例混合，并使用 Cary 3500 紫外-可見分光光度計測定 DAR。圖 2 顯示了 ADC 和未偶聯(lián)抗體混合物的紫外-可見光譜圖。使用公式 2 計算 DAR。ADC 的藥物分子 DM1 在 252 nm 處有強(qiáng)吸收，與赫賽汀主要發(fā)色團(tuán)在 280 nm 處的吸收不同[4]，如圖 2 所示。正如預(yù)期的那樣，DAR 值隨著溶液中 mAb 和 ADC的比例不同而發(fā)生變化。